在生物制药领域，药物的成药性评估是确保产品安全、有效及可生产的关键环节。其中，蛋白溶解度作为一个核心指标，对药物的稳定性、生物利用度及安全性具有深远影响。随着高浓度制剂需求的日益增长，如何在早期阶段快速、准确地评估蛋白溶解度，成为了药物研发的一大挑战。夏尔巴生物通过创新的PEG沉淀法，以极低的蛋白需求量实现了对候选药物溶解度的精准预测，进而助力客户高效筛选出最具潜力的药物分子，并成功开发出多个高浓度制剂。
药物的成药性评估（Developability assessment）作为QbD（质量源于设计）指南的延伸，能够为产品信息和工艺理解建立联系。该评估包含生产可行性（产率、稳定性、聚集性等）、特定给药途径的可行性以及与体内环境的兼容性（如免疫原性、脱靶效应和半衰期）。简而言之，可开发性评估用于支持选择候选药物，提前识别潜在风险并提供必要风险缓解措施，以满足生产、制剂和安全特性的要求。蛋白溶解度是成药性评估中的一项关键指标，本文着重讨论溶解度在成药性评估中的作用和方法。开发高浓度制剂的抗体需要具有足够的溶解性和稳定性，才能在生产、储存和给药期间维持目标治疗活性。皮下自主注射由于具有较高的病人顺应性，是当前生物制剂领域重要的发展趋势之一，在多数情况下为达到期望的生物学活性抗体溶液的制剂浓度需要50 mg/mL以上，因此，抗体药物的溶解度对其高浓度制剂的开发以及提高病人顺应性至关重要，也会直接影响下游纯化和制剂工艺的开发。抗体通常在较高浓度（>50 mg/mL）下才出现溶解度问题，是区别于乳光和高黏度问题的另一种胶体不稳定现象。表征高浓度制剂分子相互作用的大部分技术通常较为繁琐、通量较低且蛋白需求量较高。例如，传统溶解度分析（如超滤浓缩）一般需要几百毫克抗体的需求量，较高的蛋白需求严重限制了早期抗体发现阶段对于溶解度的评估，同时也失去了通过蛋白质工程提高溶解度的机会。在项目早期筛选阶段使用少量蛋白确定分子的溶解度对于项目的整体开发能实现明显的获益。在抗体发现或抗体工程阶段一般评估成百上千的抗体，而每个抗体只有少量的材料供评估。虽然有许多高通量方法可评估抗体的结合活性和构象稳定性，但只有几种方法可评估蛋白的溶解度或胶体稳定性。当前行业内已有技术可用少量蛋白预测溶解度快速检测，如Cross-interaction chromatography (CIC)、affinity-capture self-interaction nanoparticle spectroscopy (AC-SINS)、clone self-interaction by bio-layer interferometry (CSI-BLI)等，这些方法可在较低蛋白浓度条件下评估抗体的交互作用或自作用，预测抗体在高浓度下的行为。其中一些方法需要添加非特异性抗体（例如CIC使用了多克隆人源IgG，AC-SINS中使用多克隆抗体捕获抗体）；
几乎全部方法都接触了非典型界面（如金属颗粒、层析填料），这样可能需引入非特异性界面作用去确认分析结果；
高浓度抗体的行为也可以通过动态光散射（DLS）检测的相互作用参数（KD）来预测。先前的研究已经指明KD可作为评估蛋白胶体稳定性的定量筛选方法，尤其是涉及粘度和相分离。然而该方法需要一定的蛋白浓度范围，一般是1 mg/mL到20 mg/mL。如果应用于高通量筛选多个制剂处方，KD检测则需要≥20 mg蛋白，这种方法更适用于一些分子在后期开发阶段的制剂处方筛选。也有研究观察到KD和蛋白粘度之间存在冲突的关系，尤其是在低离子强度条件下，因此仅采用KD预测蛋白在高浓度条件下的行为存在一定的挑战。在生物化学领域，采用蛋白沉淀去研究蛋白溶液行为由来已久，如溶解度和相分离。这些早已应用于蛋白纯化、蛋白结晶和液-液相分离，如通过添加硫酸铵（AS）或聚乙二醇（PEG）诱导蛋白在低浓度下发生沉淀，其中PEG主要通过体积排阻效应（“分子拥挤”）起作用，AS则通过改变分子的相互作用。因此，基于蛋白沉淀法的一般原理是添加不同浓度的沉淀剂，在分离可溶物和不可溶物之后检测游离的可溶性蛋白浓度。图1. 在抗体溶液中PEG诱导体积排阻反应原理图（参考文献：Pharm Res (2021) 38:1947–1960）大部分研究使用PEGmid、PEGonset浓度作为蛋白溶解度检测的一种指标，这与其他预测性指标如KD有较好的相关性。还可以采用显微镜去定量分析沉淀物和其他作用如相分离，或者直接使用比浊法检测沉淀。该方法的优势在于所需蛋白浓度较低（1 mg/mL左右），可优化分析方法应用于高通量筛选。有文献指出在筛选离子型辅料时PEG沉淀法也许优于DLS的KD检测。因此，对于有挑战性的分子，在早期制剂筛选时可采用这种方法进行缓冲液的初筛。表1研究结果表明蛋白溶解性和PEGonset值存在一定的相关性，说明该方法可用于分子溶解性的初步判断，同时也为后续先导分子缓冲液的快速和高通量筛选提供助力。表1. 抗体在指定制剂处方条件下的溶解度分析（参考文献：MABS 2019, VOL. 11, NO. 4, 747–756）夏尔巴制剂开发部建立了一套基于PEG沉淀法初筛制剂处方的开发流程，单个供试品蛋白添加量为100 μg。采用单一PEG浓度筛选30组制剂处方，蛋白需求量仅需4 mg。我们为客户准备了三十余种缓冲液配方、二十种辅料配方进行PEG沉淀法初筛，为高浓度制剂处方开发缩小筛选范围，提高高浓度制剂研制的成功率，目前已成功支持五个200 mg/mL 的抗体制剂处方开发。在药物开发的早期阶段，候选分子呈现“分子种类多，每种分子样品量少”的特点，因此如何用极少量样品去快速、有效预测多种候选分子可开发成高浓度制剂成为行业内的迫切需求。我们采用PEG梯度沉淀法将候选分子进行溶解度测试，样品量仅需2 mg，描绘各分子在PEG浓度梯度下的溶解度曲线，筛选出在溶解度方面具有一定优势和差异的候选分子。后续我们将这些有潜力的候选分子进行制剂处方开发和优化，最终成功开发成稳定性较好的150mg/mL或200mg/mL的高浓度制剂。疏水性较强的候选分子在早期成药性表现上通常有溶解度较低、聚体稳定性较差等问题，这对后续研制稳定的制剂配方带来了一定的挑战。为提高制剂研发的成功率、加快项目的推进，我们在进行制剂处方筛选前，采用18%PEG沉淀法对蛋白在辅料组合中的蛋白浓度进行由高至低的排序，筛选出溶解度较佳的辅料（见图4），这大大缩窄了后续制剂处方筛选的范围，减少研发蛋白用量，提高研发效率。在后续制剂处方筛选时，我们也发现相比于溶解度低的辅料组合制剂，溶解度较高的辅料组合制剂在加速和高温条件下表现出较佳的聚体和片段稳定性（见图5），在一定程度上提高了制剂研制成功的成功率。图5. 溶解度较低和较高的两个制剂在加速和高温条件下聚体和片段变化趋势对比图1.Ecker, D.M., Jones, S.D., & Levine, H.L.. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 2015, 7(1), 9-14.2.Shire, S.J., Shahrokh, Z., & Liu, J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2004, 93(6), 1390-1402.3.Qin C., James S., Caroline W., etc. Development of a high-throughput solubility screening assay for use in antibody discovery. MABS. 2019, 11(4), 747–756.Joanthan Z., Tarik K., Maniraj B., etc. High concentration formulation developability approaches and considerations. MABS. 2023, 15(1), 2211
夏尔巴生物专注于提供抗体、融合蛋白、ADC（抗体偶联药物）等药物的研发和商业化生产，致力于“帮助优质客户开发出全球老百姓用得起的高质量生物药”。公司已组建了一支具有丰富经验的国际化人才团队，并助力完成了50多个项目的申报注册以及14个产品的国内外上市，满足了350多万病人的用药需求。目前，夏尔巴生物在苏州已有60,000L的总产能，生产线的建设标准同时符合NMPA、FDA和EMA等GMP要求。同时，夏尔巴生物在杭州基地已建成80,000L产能，另有92,000L产能正在二期规划中。夏尔巴生物致力于为优质客户提供优质的技术服务，可提供行业领先的一站式解决方案，协助客户加速将创新成果实现商业化，惠及更多患者。“利他以恒，匠心致远”，以分享、帮助、成就、共赢的理念，帮助优质客户开发出全球老百姓用得起的高质量生物药，是夏尔巴生物的理想和目标。
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2025-06-15
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