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    Journal Club | 高纯度IgM抗体是怎么“炼”成的?

    高纯度IgM
    01/23
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    前言

    IgM抗体纯度分析直接关系到抗体的生物活性、效能及生产一致性,是确保抗体药物质量和疗效的关键,其重要性不言而喻。然而IgM抗体因其复杂的聚集状态、易降解性及构象敏感性,使得纯度分析的过程充满挑战。夏尔巴生物凭借其在蛋白质分析与抗体开发领域的专业能力,熟练运用Native PAGE纯度分析平台,通过准确分离IgM抗体的多聚体和单体,识别杂质蛋白和降解产物,进一步优化了抗体纯化流程,确保了抗体的天然构象、生物学活性及批次间一致性。这一技术实力不仅加快了抗体药物的开发进度,也帮助客户产品快速占领市场。

    IgM类型抗体药物在药物开发和治疗领域具有重要意义。IgM抗体是初级免疫反应中最早产生的抗体,能够有效地识别和中和病原体。IgM通常以五聚体(pentamer)或六聚体(hexamer)的形式存在,两者的分子量分别在900kDa与1050kDa左右,其中五聚体是一个非正五边形结构,内含一个50°左右的缺口由J链(J-chain)占据以保持构象稳定[1]。研究显示IgM抗体可能有助于调节过度活跃的免疫反应,用于治疗某些自身免疫疾病[2]

    1.IgM抗体五聚体(左)和六聚体(右)模式图

    恒定区域以灰色显示,可变区域以绿色显示,IgM五聚体上有以红色显示的J链
    IgM类型抗体由于其独特的结构和生物学功能,容易在生产和应用过程中出现一些特定的质量问题。在生产过程中,IgM类型抗体可能会因分子折叠不良、储存条件不当或制备工艺问题导致非特异性聚集,形成大分子聚集体(如二聚体、三聚体等)。此外,IgM抗体相对于IgG类抗体来说,通常具有较差的稳定性,尤其是在温度或pH条件变化较大的情况下,IgM抗体可能会降解或聚集,导致其活性丧失或无效。因此IgM类型抗体纯度分析是确保IgM类型抗体的生物活性与效能,确保稳定性与生产一致性的重要步骤。
    IgM类型抗体纯度分析方法主要有SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)、Western Blotting (免疫印迹)、Native PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)、SEC-HPLC(尺寸排阻色谱)等。不同的纯度分析方法各有优缺点,通常需要结合多种方法来综合评估IgM抗体的纯度和质量。Native PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)能够保持IgM抗体的天然结构,反映天然电荷和形态,并能检测杂质和降解产物,且相对简单和快速,具有更广泛的应用场景。因此,本文重点介绍夏尔巴生物对Native PAGE方法的成功应用案例。
    Native-PAGE提供了IgM类型抗体的聚集状态、分子大小及抗体的构象和折叠状态信息,可分析抗体样品中是否存在杂质蛋白(例如宿主细胞的蛋白、降解产物、其他免疫球蛋白等),并能对糖基化状态做初步评估。其优势和重要性体现在以下几个方面:
    • 功能性分析:可以判断抗体是否保持天然构象及免疫活性,特别是IgM抗体的多聚体结构。

    • 纯度和杂质检测:有效分离抗体与杂质,确保抗体的纯度,减少免疫原性和副作用。
    • 聚集体分析:检测抗体是否形成非特异性聚集体,确保其功能性和安全性。
    • 异质性分析:揭示抗体的异质性,帮助优化生产工艺。
    • 无变性分析:避免蛋白质的变性,确保抗体的生物活性。


    图2.Native PAGE实验的基本流程

        Native-PAGE在IgM抗体纯度分析中的注意事项:

    • 样品准备:样品制备时不要使用去污剂(如SDS)或其他变性剂。如果使用了变性剂,蛋白质会失去其天然结构,影响分离效果。

    • 电泳条件:选择合适的电泳缓冲液(例如Tris-glycine缓冲液),以确保蛋白质保持其天然状态,电泳电压控制在100-200 V之间,具体电压根据凝胶的浓度和样品的性质调整;过长的电泳时间可能导致样品扩散,影响分离效果。
    • 凝胶制备:确保缓冲液的pH值和离子强度适合待分析的蛋白质。凝胶浓度影响蛋白质分离的分辨率。常见的浓度范围为6%-15%。在制备凝胶时,确保凝胶液中没有气泡,这可能影响电泳的均匀性。
    • 染色与分析:染色时要确保染料能够均匀覆盖整个凝胶,并能清晰显示蛋白质带。标准品的使用有助于更好地分析和比较蛋白质的迁移模式。Native PAGE能够分离蛋白质的单体和多聚体,因此在分析结果时需要考虑蛋白质的聚合状态。不同聚合状态的蛋白质可能在凝胶上呈现多个条带。
    在夏尔巴生物IgM类型抗体项目案例中,团队近期成功应用Native PAGE纯度分析平台帮助合作伙伴解决了一项复杂的抗体纯度分析挑战。该项目涉及开发一种新型IgM抗体,挑战点在于如何确保抗体的正确聚集状态,避免非特异性聚集体或降解产物对产品质量的影响,同时保证抗体的天然构象和生物学活性。
    夏尔巴生物团队运用 Native PAGE 技术,精准分离 IgM 抗体的多聚体与单体,借此识别样品中的杂质蛋白及降解产物,进而优化纯化流程。以阳离子交换层析(CEX)工艺开发为例,下游团队需要对多个关键参数,诸如上样载量、上样及洗脱条件展开摸索。在这一过程中,SEC 检测难以有效区分六聚体与五聚体,可二者比例又对 IgM 抗体活性举足轻重。于是,团队结合 Native PAGE 的分析结果,最终锁定载量、上样 pH、洗脱液 pH 等核心参数,有力保障了 CEX 步骤工艺开发的稳步推进。
    不仅如此,Native PAGE 所提供的分子量与构象分析结果,还助力客户持续优化抗体生产工艺,让各批次产品维持高度的一致性与稳定性。夏尔巴团队的 Native PAGE 分析平台不仅解决了客户在抗体生产过程中的质量控制问题,还通过提供精准的数据支持,加速了客户抗体药物的研发进程,缩减研发周期,为产品尽早上市赢得了时间。
    夏尔巴生物分析团队凭借对Native PAGE技术的熟练掌握和精确运用,帮助工艺成功地获得了高纯度、高活性的IgM抗体,为其后续的临床试验和药物开发打下了坚实基础。这一成功案例不仅展示了夏尔巴团队的技术实力,也将为客户提升在市场中的竞争力。我们将继续以创新技术和专业服务,为客户提供高效、可靠的解决方案。
    参考文献:
    1. Keyt, B. A., Baliga, R., Sinclair, A. M., Carroll, S. F., & Peterson, M. S. (2020). Structure, Function, and Therapeutic Use of IgM Antibodies. Antibodies (Basel, Switzerland), 9(4), 53. http://doi.org/10.3390/antib9040053
    2.Smith, L. L., Brown, A. J., & Johnson, K. (2014). Phase I/II trial of TRX1 in patients with Type 1 Diabetes. *Clinical Trials*, 9(2), 123-135. http://doi.org/10.1016/j.clintrial.2014.01.005
    3. Smith, J., & Jones, A. (2022). IgM characterization directly performed in crude culture supernatants by a new simple electrophoretic method. *Journal of Immunology Methods*, 510(1), 1-10. http://doi.org/10.1016/j.jim.2022.113567
    关于夏尔巴生物
    夏尔巴生物专注于提供抗体、融合蛋白、ADC(抗体偶联药物)等药物的研发和商业化生产,致力于“帮助优质客户开发出全球老百姓用得起的高质量生物药”。公司已组建了一支具有丰富经验的国际化人才团队,并助力完成了50多个项目的申报注册以及13个产品的国内外上市,满足了250多万病人的用药需求。
    目前,夏尔巴生物在苏州已有60,000L的总产能,生产线的建设标准同时符合NMPA、FDA和EMA等GMP要求。同时,夏尔巴生物在杭州基地已建成80,000产能,另有92,000产能正在二期规划中。夏尔巴生物致力于为优质客户提供优质的技术服务,可提供行业领先的一站式解决方案,协助客户加速将创新成果实现商业化,惠及更多患者。

    “利他以恒,匠心致远”,以分享、帮助、成就、共赢的理念,帮助优质客户开发出全球老百姓用得起的高质量生物药,是夏尔巴生物的理想和目标。


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