PARP-1属于PARP蛋白质家族的一员，大部分成员位于细胞核内。尽管这些蛋白质的功能各异，但它们都具有一些共同的基序，包括一个DNA结合域、一个保守的催化域和一个由胱天蛋白酶（caspase）切割的域（3-6）。当PARP-1与受损DNA中的SSB或DSB结合时，其构象发生变化，并合成聚(ADP-核糖)或PAR链，同时消耗NAD+。这些附着在PARP-1底物（包括PARP-1自身）上的PAR链会触发其他酶的活动，控制包括DNA修复在内的多种细胞反应（7）。

PARP-1在各种细胞死亡形式中的作用已经被广泛研究。虽然涉及多个复杂的途径，但其作用机制通常包括所谓的“自杀性蛋白酶”作用，这些蛋白酶将PARP-1切割成特定的小片段，每个片段分别调控独特的细胞死亡通路 (4）。最著名的例子是caspase-3或caspase-7切割PARP-1，从而抑制DNA修复过程，最终导致程序性细胞死亡或凋亡（4）。

考虑到PARP-1在修复受损DNA中的重要性，人们可能会觉得投入大量精力开发PARP-1抑制剂似乎自相矛盾。然而，在癌症治疗中，放射疗法或化疗都是设计通过破坏肿瘤细胞的DNA使其到达无法避免死亡的程度。在这种情况下，阻止细胞自然的DNA修复机制发挥作用是理想的。此外，对于由一个或多个DDR通路缺陷引起的癌症，肿瘤细胞分裂速度更快，且相比正常细胞只拥有部分功能性的DDR相关酶。这种差异使得利用特定DDR抑制剂以“合成致死性”的方式更容易靶向并摧毁肿瘤细胞，同时保护正常细胞不受伤害（8,9）。

首批获得临床批准的PARP抑制剂就是利用合成致死策略来治疗由BRCA突变引发的乳腺癌和卵巢癌（10）。目前大多数PARP-1抑制剂通过与PARP-1的催化域结合，抑制底物上PAR链的添加，并将PARP-1困在DNA损伤位点（9）。被困住的PARP-1会阻止DNA复制，导致基因组不稳定。进一步来说，这些复制缺陷细胞释放出胞浆DNA，激活适应性免疫反应，从而消灭肿瘤细胞（9）。

尽管过去十年我们对PARP抑制剂的工作原理有了显著的理解提升，但仍有许多知识需要探索。诸如对PARP抑制剂的抗药性问题以及PARP抑制剂联合化疗治疗效果参差不齐等挑战（9），必须在临床环境中解决，以改善治疗结果。进一步的研究应能细化治疗策略，最大限度地发挥这一有前景的抗癌药物类别的潜力。

Promega 提供了各种检测和技术，促进PARP/DDR通路药物的发现。包括用于检测化合物与通路组分结合的靶标占据检测、PARP和激酶活性检测以及细胞健康监测。

NanoBRET^® TE 技术可提供灵敏、特异性高的方法来测量小分子药物与其靶蛋白在活细胞中的相互作用，可用于表征PARP抑制剂对多种PARP的选择性和亲和力。细胞内滞留时间可以用一种简单的形式进行评估，即在添加示踪剂之前，添加未修饰的化合物。洗去化合物后，添加示踪剂，并对活细胞中的滞留时间进行测定。

上图. PARP1抑制剂对于未经深入研究的PARP作用复杂。经FDA批准的临床PARP抑制剂在细胞中可结合一系列mono-PARPs

DNA损伤时， PARP活性被上调。单体NAD(+)被消耗，并在损伤处经酶促聚合反应形成聚ADP核糖基化链，或将单ADP核糖添加至目标底物中。

生物发光NAD/NADH-Glo™ Assay 检测试剂盒是一种可在细胞裂解物等生物样品中，检测NAD(+)和NADH，并测定其比例的均质测定法。简单的“加样-读取”模式可适用于高通量筛选。可根据实验需求调整方案，用于测量PARP和其他酶的活性。

上图. PARP活性检测。在384孔板中，在含有PARP1、375ng 核小体和20μM NAD的反应中测量PARP1活性。经过一小时孵育后，通过添加同等体积的经修改的 NAD/NADH Glo™ Detection Reagent，分析NAD水平。20分钟后，记录发光信号。图A：滴定PARP1酶（体积：5μl）。图B：PARP1抑制

1. ADP-Glo™ Assay是一种适用于所有激酶研究的通用体外生化测定法。该检测可测定激酶反应中生成的ADP。ADP可转化为ATP，可用于生成稳定的发光信号。

2. NanoBRET^® TE Kinase Assays 可用于定量检测活细胞内化合物与全长激酶的结合。该检测可对340多种激酶，包括许多参与DDR的激酶（例如，CHK1、CHK2、CDK2/ Cyclin A1、CDK2/Cyclin E1、CDK6/ Cyclin D、PKMYT1、PLK家族、CK2α亚型、MAPKAPK2（MK2）、MARK3、Wee1）。每个激酶都有单独的使用说明。

3. 使用Lumit^®  Immunoassay Cellular Systems 可研究DNA损伤应答中的信号节点。该方法是一种无需洗涤的生物发光免疫分析，可直接测量细胞裂解物中的目标分析物。该分析可以定制，以检测参与DNA损伤应答的信号节点，使用简单的工作流程，不需要培养液移除或裂解物转移。只需将标记抗体添加至样本中，添加检测试剂，读取发光信号——所有步骤都在同一块检测板中完成！有步骤都在同一块检测板中完成！

我们提供了多种检测组合用于测定细胞活性。这些可自动化的、实时的或终点的分析方法都可使用简单的“加样-混合-读取”模式，是二次筛选和先导物优化的理想选择。可测定候选药物对活细胞（包括3D培养中的细胞）的细胞健康和细胞毒性的影响。CellTiter-Glo^® 2.0 Cell Viability Assay是一种高灵敏度的检测，具有广泛的线性范围。可用于384孔板和1536孔板，进初次筛选使用。

参考文献：

（1）Chatterjee, N. and Walker, G.C. (2017) Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environ. Mol. Mutagen. 58(5), 235–263.

（2）Li, L-Y. et al. (2021) DNA repair pathways in cancer therapy and resistance. Front. Pharmacol. 11, 629266.

（3）Boulares, A.H. et al. (1999) Role of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage in apoptosis. J. Biol. Chem. 274(33), 22932–22940.

（4）Chaitanya, G.V. et al. (2010) PARP-1 cleavage fragments: signatures of cell-death proteases in neurodegeneration. Cell Commun. Signal. 8, 31.

（5）Morales, J.C. et al. (2014) Review of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) mechanisms of action and rationale for targeting in cancer and other diseases. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 24(1), 15–28.

（6）Bai, P. (2015) Biology of poly(ADP-ribose) polymerases: The factotums of cell maintenance. Mol. Cell 58, 947–958.

（7）Ko, H.L. and Ren, E.C. (2012) Functional aspects of PARP1 in DNA repair and transcription. Biomolecules 2, 524–548.

（8）Cheng, B. et al. (2022) Recent advances in DDR (DNA damage response) inhibitors for cancer therapy. Eur. J. Med. Chem. 230, 114109.

（9）Wicks, A.J. et al. (2022) Opinion: PARP inhibitors in cancer—what do we still need to know? Open Biol. 12, 220118.

（10）Faraoni, I. and Graziani, G. (2018) Role of BRCA mutations in cancer treatment with poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitors. Cancers 10, 487.