基于HiBiT标记技术的蛋白质动态综合分析：蛋白定位、蛋白质相互作用和降解
本文展示了HiBiT标签在天然和药理学诱导环境中实时捕获SMARCA2生物学动态事件的能力。这些发现共同突显了HiBiT作为一种强大的标记系统在基础和应用研究中的多功能性。凭借其跨平台的检测兼容性，HiBiT为研究内源性蛋白质行为提供了新方法，不仅有助于更深入地理解复杂的生物过程，还为药物发现和治疗开发提供了有力工具。
关键词：免疫分析，生物发光检测，蛋白定位，靶向蛋白降解，PROTAC，蛋白互作。
快速了解本篇文章介绍重点。
背景介绍
研究蛋白质动力学对于理解细胞过程如何被调控及其在生物学中的作用至关重要。HiBiT蛋白质标签系统为在天然环境中研究蛋白质提供了强大的工具。
● HiBiT是一个由11个氨基酸组成的小肽，可以通过CRISPR介导的敲入策略附加到内源性蛋白质上。
● 可对内源性蛋白质进行标记，避免过表达伪影以及对蛋白质功能或定位的干扰。
● HiBiT与NanoBiT®分裂萤光素酶报告基因的多肽组分LgBiT之间的高亲和力，使得对HiBiT标记靶标的检测具有极高的灵敏度。
● HiBiT和LgBiT的互补产生了一个明亮的生物发光信号，可用于蛋白质的定量和功能分析。
● 除了发光检测外，HiBiT还可以作为免疫沉淀（IP）和免疫荧光的亲和标签。
Promega公司开发了一系列HiBiT检测方法，使得该标签具有极高的多功能性，使研究人员能够在天然细胞环境中或通过药理学驱动的机制（如靶向蛋白质降解）探索蛋白质生物学的多个领域，包括定位、降解、翻译后修饰和蛋白质-蛋白质相互作用。
本文展示了HiBiT标签在研究SMARCA2中的应用。SMARCA2是SWI/SNF染色质重塑复合物的一部分，并且是一个关键的肿瘤学靶点，目前已有多种降解分子进入临床试验阶段2,3。通过CRISPR技术和克隆筛选，我们建立了在内源性SMARCA2基因位点3’端插入HiBiT标签的HeLa细胞系。通过对靶标进行内源性标记并使用基于HiBiT的分析工具，我们实现了对SMARCA2生物学的全面解析。
本文结合HiBiT免疫分析和发光检测，展示了天然SMARCA2）的定位、与SWI/SNF复合体组分的关联、诱导性SMARCA2降解的动力学以及SMARCA2降解剂的作用机制。
SMARCA2-HiBiT的验证
01
SMARCA2-HiBiT的定位
HiBiT标签系统能够追踪内源性蛋白质的细胞定位。通过免疫细胞化学显微成像技术，使用Anti-HiBiT Monoclonal Antibody确认了SMARCA2-HiBiT在细胞核中的正确定位（图1）。这些图像表明，HiBiT标签不会破坏SMARCA2的核定位及其在染色质重塑中的已知作用。
图1. SMARCA2-HiBiT HeLa CRISPR细胞系的免疫细胞化学分析
细胞经过固定后，使用抗HiBiT单克隆抗体、抗小鼠AlexaFluor® 488二抗和Hoechst染色剂进行处理。观察到SMARCA2-HiBiT在细胞核中的定位，与预期一致。
02
相互作用伴侣的验证
在确认SMARCA2-HiBiT的正确定位后，我们进一步验证了其在细胞核内与其他蛋白质的相互作用。使用Anti-HiBiT Magne® Beads从细胞裂解液中捕获含有SMARCA2-HiBiT的复合物。通过质谱（MS）分析磁珠洗脱物，以鉴定SMARCA2的天然相互作用伴侣。
图2. SMARCA2-HiBiT复合物的IP-MS分析A. Anti-HiBiT Magne Bead IP洗脱物的火山图，比较SMARCA2-HiBiT CRISPR敲入细胞与HeLa亲本细胞对照。 B. SWI/SNF复合物成员的示意图。通过质谱分析鉴定出的蛋白质以彩色显示。
对SMARCA2-HiBiT免疫沉淀（IP）样品的分析显示，许多已知的SWI/SNF复合物成员被显著富集，其中包括该复合物染色质重塑功能所必需的12个关键蛋白质中的10个（图2）。对已确认SWI/SNF组分的鉴定突显了HiBiT CRISPR细胞系保留天然相互作用谱的能力。此外，Anti-HiBiT Magne® Bead的灵敏度和特异性使得能够稳健地捕获内源性表达的HiBiT标记蛋白及其相关相互作用伴侣蛋白。有趣的是，SMARCA2-HiBiT样品的IP-MS分析还鉴定出SWI/SNF复合物之外的辅助蛋白作为潜在的相互作用伴侣。其中一些蛋白质在染色质组织和基因调控中具有已知功能，这表明SMARCA2可能存在一个更广泛的相互作用网络，需要进一步探索。
SMARCA2蛋白质动力学研究
01
使用PROTACs研究靶向蛋白质降解
由于SMARCA2与其旁系同源蛋白SMARCA4在结构上高度相似（两者都是SWI/SNF染色质重塑复合物的核心组分），因此靶向SMARCA2历来具有挑战性。传统的小分子抑制剂通常缺乏区分这两种蛋白的特异性，导致脱靶效应和治疗效果有限。靶向蛋白质降解剂，如蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs），可能通过促进SMARCA2的选择性降解来解决这一问题。PROTACs是双功能分子，能够将靶蛋白招募到E3泛素连接酶，从而导致其泛素化和随后的降解（图3）。由于其催化作用机制，靶向蛋白质降解剂有望以较低浓度实现更强的治疗效果并具有更持久的药理作用。这对于SMARCA2失调参与发病机制的疾病尤其有价值。
图3. PROTAC介导的靶蛋白降解的关键步骤。PROTACs首先必须表现出细胞渗透性，并与靶蛋白和E3连接酶形成三元复合物。这导致靶蛋白的泛素化，随后被招募到蛋白酶体并降解。彩色符号分别代表靶蛋白（蓝色）、E3招募元件（浅蓝色）和泛素（粉色）。
02
使用NanoBRET®监测三元复合物的形成
在表征了SMARCA2的天然相互作用网络后，我们进一步研究了靶向SMARCA2降解的ACBI1蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）的作用动力学和机制。我们利用NanoBRET®技术检测三元复合物的形成和靶蛋白泛素化，这些是PROTAC作用机制中的关键步骤。NanoBRET®系统与HiBiT标记相结合，提供了一种灵敏的实时方法，可直接在活细胞中监测这些被诱导的相互作用。
当PROTAC同时结合靶蛋白和效应E3连接酶时，三元复合物形成。NanoBRET®通过能量转移报告复合物的形成：当靶蛋白和E3连接酶接近时，互补的HiBiT-LgBiT作为发光能量供体，将能量转移至HaloTag®荧光受体。为了测量三元复合物的形成，在SMARCA2-HiBiT细胞中共表达LgBiT和HaloTag®-VHL（代表ACBI1 PROTAC招募的E3泛素连接酶）。在细胞接种到检测板中时，加入HaloTag® NanoBRET® 618配体。第二天，细胞分别用1 µM ACBI1或DMSO处理2小时，随后加入NanoBRET® Nano-Glo®底物，并在GloMax® Discover上测量NanoBRET®比率。与DMSO处理的细胞相比，ACBI1处理的细胞NanoBRET®比率增加，表明PROTAC促进了SMARCA2-VHL复合物的形成（图4），支持了VHL介导的SMARCA2降解机制。
图4. 用ACBI1 PROTAC处理后，SMARCA2-HiBiT被招募到E3连接酶HaloTag®-VHL上。
03
使用NanoBRET®监测泛素化
除了三元复合物的形成，我们还使用NanoBRET®评估了SMARCA2的泛素化——这是标记蛋白质用于蛋白酶体降解的关键翻译后修饰。通过用HaloTag®标记泛素蛋白作为能量受体，我们同样能够使用NanoBRET®检测ACBI1处理后SMARCA2-HiBiT的泛素化。在细胞接种到检测板中时，加入HaloTag® NanoBRET® 618配体。第二天，细胞分别用1 µM ACBI1或DMSO处理2小时，随后加入NanoBRET® Nano-Glo®底物，并在GloMax® Discover上测量NanoBRET®比率。ACBI1 PROTAC处理导致SMARCA2-HiBiT的泛素化水平比DMSO处理高出约3倍（图5）。这种方法提供了三元复合物形成与后续泛素化之间的直接联系，阐明了ACBI1降解SMARCA2作用机制的分步过程。
图5. 用ACBI1 PROTAC处理后，SMARCA2-HiBiT的泛素化程度显著增加。
04
活细胞中SMARCA2-HiBiT的降解动力学
在评估了三元复合物形成和泛素化后，我们进一步研究了活细胞中SMARCA2降解的动力学。选择ACBI2来诱导活细胞中的降解。ACBI2是一种专门设计用于靶向SMARCA2的PROTAC，而ACBI1则同时靶向SMARCA2和SMARCA4。使用HiBiT标签系统进行活细胞中蛋白质降解的动力学定量具有显著优势，包括最大限度地降低忽略动态细胞反应的风险，这些反应可能在单独的终点检测中被遗漏。
为了定量SMARCA2-HiBiT的降解，我们首先通过ViaScript™ LgBiT mRNA Delivery System将LgBiT引入活细胞中。第二天，向细胞中加入Nano-Glo® Endurazine底物，并平衡2.5小时，随后用一系列梯度稀释的ACBI2处理细胞。在24小时内持续监测SMARCA2-HiBiT细胞的发光信号（图6）。实时降解曲线显示，SMARCA2在PROTAC处理下表现出快速、强效且近乎完全的降解，并且这种降解效果随时间持续存在。
图6. ACBI2处理后SMARCA2-HiBiT水平的活细胞降解
动力学曲线为ACBI2的作用以及从三元复合物形成到蛋白酶体降解的所有机制步骤的效率提供了关键见解。这些数据对于优化基于PROTAC的治疗策略具有重要价值，通过量化浓度、时间和降解效果之间的关系，有助于更明智的化合物排序，并更深入地了解降解剂的作用模式。
HiBiT技术凭借其高灵敏度和非侵入性标记，实现了靶向处理后蛋白质水平的活细胞精准监测。通过将阐明靶向蛋白质降解剂动力学和机制步骤的检测方法与蛋白质定位及天然蛋白质相互作用的发现相结合，我们在天然细胞环境中全面了解了诱导SMARCA2降解的过程。这凸显了HiBiT技术在内源性细胞调控下详细研究蛋白质动力学的价值。
总结
HiBiT标签系统以其小尺寸、高灵敏度以及与多种检测平台的兼容性，成为研究内源性细胞环境中蛋白质动力学的多功能工具。在本研究中，我们展示了HiBiT在表征SMARCA2生物学多个方面时的实用性：
维持天然特性：SMARCA2-HiBiT被证明定位于细胞核，符合染色质重塑蛋白特性。此外，IP-MS分析显示，SMARCA2-HiBiT与预期的SWI/SNF复合物核心蛋白相互作用。HiBiT捕获这些相互作用的能力展示了其在绘制蛋白质-蛋白质相互作用图谱中的灵敏度和特异性，并进一步证明了其在忠实报告内源性生物学方面的非破坏性。
靶向蛋白质降解机制的表征：通过NanoBRET®技术评估三元复合物的形成及随后的泛素化，揭示了PROTAC ACBI1将SMARCA2招募至VHL的机制。ACBI2处理的活细胞降解动力学监测揭示了剂量依赖性快速降解特征，凸显了HiBiT在动态过程研究中的优势。
参考文献：
1. Vangamudi, B., et al. (2015). The SMARCA2/4 ATPase domain surpasses the bromodomain as a drug target in SWI/SNF-mutant cancers: Insights from cDNA rescue and PFI-3 inhibitor studies. Cancer Research, 75(18), 3865-3878.
http://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-14-3798
2. Dagogo-Jack, I., et al. (2023). 713TiP A phase I study of PRT3789, a potent and selective degrader of SMARCA2 in patients with advanced or metastatic solid tumors and a SMARCA4 mutation. Annals of Oncology, 34, S493–S494.
http://doi.org/10.1016/j.annonc.2023.09.1899
3. Lee, E. C. Y., et al. (2024). Synthetic lethality: targeting the SMARCA2 bromodomain for degradation in SMARCA4-deficient tumors – a review of patent literature from 2019–June 2023. Expert Opinion on Therapeutic Patents, 34(4), 211–229.
http://doi.org/10.1080/13543776.2024.2355258
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产品 | 规格 | 目录号 |
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody | 100μg | N7200 |
ViaScript™ LgBiT mRNA Delivery System | 1 each | NE1130 |
Nano-Glo® Endurazine底物 | 0.1ml | N2570 |
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2025-06-15
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