慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者在晚期之前大多无症状，此时预后通常较差。为此，中国医学科学院、中国协和医科大学中日友好医院的科研人员，将研究重点转移到COPD前和吸烟阶段，发现低氧诱导因子（HIF）-3α可通过GPx4轴抑制肺泡上皮细胞铁凋亡防治COPD。接下来，小编就带各位老师看一下该文章的研究思路。

简单来说，作者对36例非吸烟者、吸烟者、COPD前期和COPD患者的外周肺组织标本进行bulk RNA测序，并使用Mfuzz算法对数据集进行动态分析。GSE171541和EpCAM共定位分析用于探索HIF-3α定位。并进一步采用Sftpc^Creert2/+R26^LSL-Hif3α基因敲入小鼠和小分子抑制剂体外实验，探讨HIF-3α在COPD病理生理中的作用。

作者纳入了来自非吸烟者、吸烟者、COPD前期和COPD患者的36份肺标本（表1）。在这些肺样品上使用活性氧（ROS）探针，作者发现ROS水平在COPD前阶段显著增加（图1A-B）。对这四组进行bulk RNA测序（图1C和GSE275503），使用Mfuzz计算得到了10个簇，其中，簇7和簇9在COPD前显示出强峰，这与人肺标本中的ROS特征一致（图1A）。GO分析表明，簇7具有更多在氧化还原过程（图1D）。提取簇7中的基因表达值（RPKM），并与肺功能（图1E）、血细胞计数和血液生化测试进行的相关性分析表明，HIF-3α与FEV1/FVC呈正相关，MMP9与FEV1/FVC呈负相关。这两个基因在该转录组数据集中还显示出最大的log 2倍数变化（log 2FC）值和最显著的p值（图1F）。基于HIF-3α是一种可以以更广泛的方式发挥作用的转录激活因子，作者接下来关注HIF-3α 。

图1

为了探索HIF-3α的细胞定位，作者接下来使用来自GEO的scRNA-seq数据（GSE171541），在数据集中鉴定了7种细胞类型（图2A）。为了进一步评估这7种细胞类型中HIF-3α的表达差异，作者比较了COPD组和对照组中HIF-3α的平均表达值（图2C）。结果显示，虽然HIF-3α在内皮细胞中高度表达，但其在COPD和对照组之间几乎没有变化（图2C）。但在COPD组的上皮细胞中，明显下调（图2D）。为了继续探索肺上皮细胞表达HIF-3α的亚型，作者进行了多细胞系验证。尽管人类肺最常被描述为大约22代的二分分支系统，但肺上皮细胞可分为1）用于气体传导的上气道上皮细胞2）用于呼吸的肺泡上皮细胞和3）中过渡细支气管。进一步检测HIF-3α在人气道上皮细胞（1-HAE）细胞系和人支气管上皮细胞（16-HBE）细胞系、肺泡上皮细胞（A549细胞系）和移行性细支气管上皮细胞（BCiNS1. 1）细胞系中的表达，结果显示，HIF-3α在上气道上皮细胞（1-HAE）中没有表达，但在下肺泡和移行性细支气管上皮细胞中强烈表达（图2E）。

图2

目前为止已经发现HIF-3α mRNA在COPD肺上皮细胞中表达下调，尤其是在肺泡上皮细胞中。为了在蛋白质水平上测试这种现象，作者对独立的人肺样品进行免疫组织化学和WB实验，这些样品由非吸烟者（n=5）、吸烟者（n=5）和COPD患者（n=6）的肺组成。与非吸烟者或吸烟者相比，COPD肺中HIF-3α蛋白水平显著降低（图3A-B）。通过与EpCAM共染色进一步测试了HIF-3α在上皮细胞中的定位，EpCAM被广泛用作上皮细胞的标志物。结果显示HIF-3α和EpCAM共定位于COPD肺（图3C）。与scRNA-seq数据一致，HIF-3α在肺上皮细胞中下调，并且在肺泡上皮细胞中在蛋白水平下调（图2E，3D）。此外，HIF-3α在免疫细胞中上调（图3E），在内皮细胞中降低（图3F），在支气管结构中的基底细胞中几乎不表达（图3G），在平滑肌细胞中无染色（图3F）。基于肺气肿是以肺泡上皮细胞死亡为特征，是COPD的hall marker，我们接下来重点研究肺泡上皮细胞。

图3

为了了解HIF-3α促进氧化应激的潜在机制，并为了后续体内动物实验的一致性，作者选择小鼠肺泡上皮（MLE-12）细胞进行慢病毒转染和bulk RNA测序，WB和火山plot结果显示，该方法可导致HIF-3α过度表达。对该RNA-seq数据进行了基因集富集注释（GSEA）分析，将pathway分为三个簇（图4A）：“氧化应激相关”、“免疫和感染”以及“生物合成和代谢”。在这些途径中，铁凋亡因为以脂质过氧化为特征，引起了作者的关注。

铁蛋白凋亡是一种受调节的细胞死亡，其由脂质过氧化和ROS诱导。在透射电子显微镜下，铁蛋白凋亡表现为线粒体致密且较小，膜密度增加，嵴退化。作者使用透射电子显微镜对COPD小鼠的肺组织进行了评估，以检测这些形态学变化。与对照组相比，COPD小鼠肺中的线粒体密度更高且萎缩（图4B）。在生化上，铁细胞增多症的特征是脂质过氧化和ROS水平升高。通过使用C11-BODIPY 581/591和ROS探针，发现在CSE暴露的细胞中，脂质过氧化（图4D，F）和ROS水平（图4C，E）显著增加，并可被Fer-1抑制，Fer-1被广泛用作亚铁蛋白病的抑制剂。

图4

先前的研究已经证明HIF-3α是一种转录激活因子，可以通过其basic-helix-loop-helix和Per/Arnt/Sim区域（N-末端）和反式激活结构域（N-末端）调节缺氧条件下的独特转录反应。为了评估HIF-3α和GPx4之间可能的关联，作者通过JASPAR数据库探索了转录因子结合位点。发现HIF-3α与GPx4共享特定的转录基序（图5A）; HIF-3α过表达显着促进了CSE未处理（图5B）和CSE处理（图5I）细胞中GPx4的表达。HIF-3α的过表达阻碍了细胞活力（图5C）和SOD水平（图5H）的降低，防止ROS（图5D-E）和脂质过氧化（图5F-G）的增加。提示HIF-3α的过表达可阻止关键抗氧化因子GPx4和SOD的耗竭，进而抑制肺泡上皮细胞的铁凋亡。

为了探索GPx4在HIF-3α过表达中的作用，作者用RSL3阻断GPx4（图5I）。在存在GPx4抑制的情况下，HIF-3α的过表达未能逆转由CSE刺激引起的高ROS（图5D-E）和脂质过氧化（图5F-G）。提示GPx4是HIF-3α过表达和HIF-3α-GPx4轴存在下的主要抗氧化因子。

图5

目前已经阐明过表达HIF-3α可以减轻COPD肺泡上皮细胞的铁细胞凋亡，其机制主要取决于体外激活的HIF-3α-GPx4轴。为了在体内测试这种机制，作者进一步在小鼠中构建了Sftpc^Creert2/+ R26^LSL-Hif3α敲除特异性的肺泡上皮细胞，并将其暴露于6个月的香烟烟雾中。H&E染色显示，与R26^LSL-Hif3α组相比，Sftpc^Creert2/+ R26^LSL-Hif3α组具有好得多的平均线性截距（MLI）和平均肺泡数（MAN），表明肺完整性、肺泡数的水平更高，肺气肿的存在更少（图6A-C）。此外，对各组的肺功能的测量表明，吸烟6个月的Sftpc^Creert2/+ R26^LSL-Hif3α组具有高得多的肺功能结果，如FEV0.05/FVC和FEV0.1/FVC所示（图6D-E）。通过WB和免疫荧光染色检测HIF-3α和GPx4的表达，显示HIF-3α和GPx4在Sftpc^Creert2/+R26^LSL-Hif3α组中显著上调（图6F-G）。表明HIF-3α-GPx4轴的激活能够在体内阻止肺功能的下降。

图6

接下来在TEM下检查肺泡上皮细胞中线粒体的形态特征。与WT-SPF组相比，香烟处理的野生型组（WT-CS）和阴性对照组（R26^LSL-Hif3α）的线粒体要小得多且萎缩。WT-CS组线粒体嵴断裂，膜密度增加。这些现象显示在具有较大线粒体和清晰嵴的Sftpc^Creert2/+ R26^LSL-Hif3α-CS组中减轻（图7A）。香烟暴露6个月后，分别用4-HNE和ROS探针检测各组大鼠的脂质过氧化和氧化水平。4-WT-CS和R26^LSL-Hif3α组HNE染色增强，尤其是在Ⅱ型肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞。体内肺泡上皮细胞中HIF-3α的过表达减轻了过氧化（图7B，E）和ROS水平（图7C，F）。采用TUNEL法检测肺泡上皮细胞的活性。TUNEL阳性细胞在WT-CS和R26^LSL-Hif3α组中显著增加，并且这种现象在Sftpc^Creert2/+R26^LSL-Hif3αCS组中减轻（图7D，G）。总之，HIF-3α-GPx4轴的激活通过抑制肺泡上皮细胞铁凋亡来预防COPD。

图7