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GLP-1

Co-IP—验证蛋白互作的不二之选

吉玛基因

06/16

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一、 Co-IP实验原理

CO-IP 即免疫共沉淀，是一种经典的用于研究蛋白质相互作用的分子生物学方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。基本原理是抗原-抗体特异性结合，检测目的是蛋白间相互作用。

图1 Co-IP实验原理示意图

二、Co-IP 的标准化操作流程

图2 Co-IP 的标准化操作示意图

三、 Co-IP实验图解读

在分析Co-IP结果图时，我们需要关注图中各个部分所代表的实验步骤，并结合实验结果进行综合分析。通过这样的分析，我们可以得出实验的结论，并进一步理解Co-IP实验结果的意义。

1. Co-IP实验结果示例图（非实际条带，仅供参考）

图3 Co-IP结果示例图

（A:protein X和Y有相互作用，B:protein X和Y之间不存在相互作用）

2. 示例图解释

对结果进行分析之前，还需要了解图中的标注都是什么含义：

（1）Input：阳性对照，全蛋白组；

（2）IgG：阴性对照组；

（3）IP：免疫沉淀，实验组；

（4）IB:免疫印迹WB实验结果，IB:X/Y,蛋白X/蛋白Y的WB检测结果）；

图3中的Input组是对细胞裂解液的蛋白样本进行WB检测，采用蛋白X和Y的抗体去验证蛋白样本中是否存在目的蛋白。图1 A和B的Input结果均表示存在两种目的蛋白。

IP组是用抗体的磁珠进行免疫沉淀，将得到的沉淀复合物进行WB检测，判断蛋白X和蛋白B是否存在相互作用。图1A的IP组结果显示，在IP组沉淀复合物样本中均检测到了X和Y，表明protein X和protein Y之间存在相互作用；图1B IP组的第三组样本中只有X，而没有检测到Y，代表protein X和protein Y之间不存在相互作用。

四．文献案例分析

了解Co-IP结果图一般含义后，我们再结合文献案例实战分析Co-IP的结果。（案例均引自吉玛客户发表的文章）

图4 SIRT4、PUF60和U2AF2之间存在相互作用

该图为验证蛋白PUF60、U2AF2和蛋白SIRT4是否存在相互作用的结果图。由图4可以发现，该实验被分为两组：input组及IP组，IP组分为阴性对照和实验组，在TGF-β1刺激下的TEC中，检测PUF60蛋白或U2AF2蛋白是否与SIRT4结合。用PUF60抗体和U2AF2抗体对免疫沉淀的SIRT4进行免疫印迹，结果表明TGF-β1刺激处理下导致SIRT4、PUF60、U2AF2之间相互作用。

图5 GPCPD1和 LYPLA1之间存在相互作用

图5为验证蛋白GPCPD1和蛋白LYPLA1，LYPLA2是否存在相互作用的结果图。实验分为3组，分别是input阳性对照组组，IgG阴性对照组和实验组，由对照组的条带可以得到结论：蛋白LYPLA1与蛋白LYPLA2都是存在的。IP组的第一个条带表示利用IgG进行沉淀实验，结果蛋白LYPLA1与蛋白LYPLA2没有被沉淀下来，说明蛋白X、蛋白Y不能与IgG结合（阴性对照，用于排除蛋白与抗体非特异性结合的可能性）；IP组的第二条带表示利用蛋白GPCPD1进行沉淀实验，结果蛋白LYPLA1被沉淀下来，蛋白LYPLA2没有被沉淀下来。，由图可知，在MDA468细胞中内源性LYPLA1可以与内源性GPCPD1相互作用，而内源性LYPLA2不与内源性GPCPD1相互作用。

文献来源

[1] Yang G, Xiang J, Yang X, Liu X, Li Y, Li L, Kang L, Liang Z, Yang S. Nuclear translocation of SIRT4 mediates deacetylation of U2AF2 to modulate renal fibrosis through alternative splicing-mediated upregulation of CCN2. Elife. 2024 Nov 4;13:RP98524. doi: 10.7554/eLife.98524. PMID: 39495216; PMCID: PMC11534337.

[2] Liu Y, Zhang H, Liu Y, Zhang S, Su P, Wang L, Li Y, Liang Y, Wang X, Zhao W, Chen B, Luo D, Zhang N, Yang Q. Hypoxia-induced GPCPD1 depalmitoylation triggers mitophagy via regulating PRKN-mediated ubiquitination of VDAC1. Autophagy. 2023 Sep;19(9):2443-2463. doi: 10.1080/15548627.2023.2182482. Epub 2023 Mar 1. PMID: 36803235; PMCID: PMC10392732.