前言

基于siRNA的疗法在治疗遗传性、病毒性和慢性病等疾病上表现出了巨大的潜力，但面临选择性、稳定性和递送三大挑战。siRNA的选择性和稳定性可以通过化学修饰和生信解决。而在递送方面，尽管siRNA的递送已经取得了显著的进展，比如：1）GalNAc和LNP可以将siRNA成功运输至肝脏并发挥药效作用；2）C16修饰的siRNA鞘内给药后能在CNS中产生持久而有效的基因沉默效果。但是，siRNA的肝外递送仍然存在巨大挑战。抗体对细胞表面受体的识别具有特异性，并且其递送能力已在ADC药物领域得到验证，因此近年来，抗体作为一种很有前景的寡核苷酸转运载体受到了广泛关注并且正在快速发展。

近日，Avidity公司在《药物化学》（Journal of Medicinal Chemistry）权威期刊上发表了关于抗体-寡核苷酸缀合物（AOC）构效关系研究的文章（doi: 10.1021/acs.jmedchem.4c00802）。在这项研究中，研究人员系统地研究了抗体偶联化学、siRNA化学修饰、连接子类型、核酸连接位置、聚乙二醇化和药物与抗体比率（DAR）等因素对AOC的药代动力学（PK）、siRNA递送和生物活性的影响。

1. siRNA与抗体（半胱氨酸）随机偶联策略

合成步骤：1）双链siRNA的正义链5’端氨基与NHS活化的马来酰亚胺反应生成siRNA-连接子-马来酰亚胺中间体；2）用TCEP部分还原抗体链间的二硫键，进而暴露出半胱氨酸残基的硫醇基团；3）抗体与siRNA-链接子-马来酰亚胺进行偶联；4）用脱氢抗坏血酸氧化和NEM封闭AOC（DAR=1）中剩余的半胱氨酸，形成硫醚。【封端原因：未反应硫醇可能会导致抗体聚集、二硫键混乱，并由于固定缀合物的二硫键数量减少而影响缀合物的稳定性】。

2. siRNA与抗体（Asn297）偶联策略

合成步骤：1）通过酶法在连接聚糖的Asn297上做修饰，实现以叠氮激活抗体的每条重链；2）将双功能二苯并环辛炔（DBCO）-PEG-反式环辛烯（TCO）双功能团连接子加载到抗体上的叠氮连接柄上，生成在Asn297位点具有TCO连接柄的抗体；3）在另一个反应中，将甲基四嗪NHS酯与siRNA的胺连接柄连接，生成甲基四嗪siRNA；4）在功能化抗体和siRNA之间进行TCO-甲基四嗪点击化学反应，生成DAR为1的AOC。

3. siRNA与抗体（赖氨酸）偶联策略

合成步骤：1）使用不可切断连接子琥珀酰亚胺基-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸酯（SMCC）的NHS酯与赖氨酸残基的氨基反应，将活性马来酰亚胺基团连接到赖氨酸侧链上；2）马来酰亚胺活化的抗体随后与含硫醇的siRNA反应，生成的中间体再通过阴离子交换色谱和缓冲液交换进行处理，最后得到DAR1抗体-siRNA缀合物。

在解决了AOC合成问题后，研究人员进一步评估了对抗体不同位置（半胱氨酸、赖氨酸和聚糖）偶联策略对AOC血浆PK的影响。结果显示，与半胱氨酸共轭相比，赖氨酸和聚糖共轭的siRNA的血浆清除率增加，赖氨酸共轭siRNA的血浆暴露量减少可能是由于赖氨酸偶联物的异质性更大，体内稳定性更低。虽然许多抗体-药物缀合物（ADC）对聚糖的耐受性很好，但聚糖共轭的AOC血浆暴露的少量减少是连接子稳定性还是siRNA在抗体上的位置造成的还不清楚。结合PK数据和半胱氨酸偶联的便利性，研究人员最终确定使用半胱氨酸偶联的AOC进一步开发。

DAR是ADC药物开发中的重要技术指标，为了研究AOC药物中，不同DAR对小鼠血浆PK的影响，研究人员设计并合成DAR为1、2和3的αhEGFR mAb-siRNA (DMPK) AOCs进行体内PK研究。实验结果显示，1）随着DAR的增加，血浆清除率明显呈加快趋势，DAR2的清除率是DAR1的五倍；2）进一步的实验表明，DAR2的AOC从血浆中快速清除的原因可能是肝脏的非生产性摄取增加了。肝脏的快速吸收导致肌肉中的输送量和活性降低。DAR较高的AOC可能会改变其理化性质，如尺寸增大和负电荷密度显著增加，这可能会影响其与血浆蛋白的相互作用和清除机制。基于这些数据，研究人员决定选择了DAR1进行进一步评估。

连接子是ADC药物开发成败的关键，但是连接子在AOC药物中是否同样重要，需要进一步研究。为了研究不同种类的连接子对AOC小鼠血浆PK的影响，研究人员选取：1）可裂解连接子，包括可还原二硫（SS）连接子SS（甲基）和SS（偕二甲基）和可被酪蛋白酶清除的缬氨酸-瓜氨酸（VC）连接子、3-(2-吡啶二硫)丙酸酯（PDP）和甲基-(2-吡啶二硫)甲苯（MPT）；2）不可切断连接子，包括MCC、间马来酰亚胺基苯甲酰基（MB）、4-((4-(氰基乙炔基)苯甲酰基)氧基)（CB）和双马来酰亚胺（BisMal）进行体内PK研究。实验结果显示含有不可降解MCC连接子AOC（αhEGFR-Cys-MCC-siEGFR-PEG5k）与可酶解的VC连接子AOC (αhEGFR-Cys-VC-siEGFR-PEG5k）的血浆清除率无明显差异。对含有可裂解二硫键（PDP、MPT、SS[甲基]和SS[偕二甲基）的AOCs进一步小鼠PK研究表明：连接子的稳定性对AOCs很重要，要保持这些可裂解连接子的血浆稳定性，就必须增加二硫（SS）连接子周围的立体体积。在二硫连接子中加入偕二甲基可使清除率降低40多倍，这表明增加的体积可减缓二硫在循环中的裂解。

为了比较不同不可裂解连接子的体外稳定性，研究人员设计了四种的不可裂解连接子（MCC、CB、MB和BisMal）的AOCs。将AOCs在37°C和含0.5mM谷胱甘肽的PBS中孵育后检测siRNA和抗体含量。体外实验结果表明，含有CB、MB和BisMal连接物的AOC在体外比MCCAOC更稳定。为进一步评估四种不可裂解连接子体外稳定性差异对AOC血浆PK、siRNA组织递送和靶mRNA KD效力的影响，研究人员设计了含不同连接子的αmTfR1抗体-siHprt缀合物。体内实验结果表明：所有四种AOCs的血浆清除率、siRNA浓度和骨骼肌中mRNA的减少量几乎相同。对于αmTfR1 AOC来说，使用比MCC更稳定的连接子并不能改善血浆暴露、组织递送或KD。作者认为对于像高表达的TfR1受体来说，由靶标介导的快速药物处置导致在连接子稳定性的任何差异产生影响之前，大部分AOC已被带入组织。

siRNA分子上连接子的连接位置会影响siRNA本身的稳定性，进而影响AOC体内疗效和作用持续时间。为了解连接子连接位置对siRNA稳定性的影响，研究人员设计并合成一系列AOCs来评估siRNA正义链3′或5′端及中间位置连接子对不同组织中mRNA KD的影响。结果显示：1）连接子连接siRNA正义链的3′或5′端，不会影响肌肉、心脏、肝脏和肺四种组织靶基因的敲低；2）连接子连接siRNA正义链的第7、13或17位，对血浆PK无明显影响；3）连接子连接在siRNA正义链的第8或14位，在肝脏组织中低剂量时活性较低，对双链siRNA的RISC负载有潜在影响。当剂量增加到2mg/kg后，能达到与5’端相同的最大KD；在肌肉组织中，也表明第8或14位对双链siRNA的RISC负载有潜在影响，第8位连接子可能比位于5’端的连接子受到更多阻碍，从而导致siRNA释放更慢。

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