二甲基富马酸（DMF），一种带电子亲和性的小分子药物，在治疗自身免疫性疾病方面成效显著，然而它的作用机制却一直是个谜……

直到共价筛选(Covalent Profiling)的出现，为我们揭示了DMF在T细胞中的作用机制。 

共价筛选是一种基于化学蛋白质组学的创新方法，它利用特定的化学探针，与蛋白质中的半胱氨酸残基形成不可逆的共价键，从而标记出那些与DMF具有潜在相互作用的蛋白质位点。这项技术不仅能够捕捉到DMF的瞬间“足迹”，还能精确地描绘出它在细胞内部活动的地图。      

研究摘要：

二甲基富马酸酯（DMF）是一种广泛应用于治疗自身免疫性疾病（如多发性硬化症和银屑病）的亲电药物。

目前的研究表明，DMF可能通过共价修饰蛋白质发挥作用，或者作为前药转化为单甲基富马酸酯（MMF）后产生生物学效应。利用competitive isoTOP-ABPP的方法，作者测定了人类T细胞中超过2400个半胱氨酸残基对DMF的敏感性。

在几个与T细胞功能有已知生化或遗传联系的蛋白质中，鉴定出了对DMF而非MMF敏感的半胱氨酸，包括蛋白激酶Cθ（PKCθ）。DMF通过扰乱该激酶C2结构域中的CXXC基序，阻止了PKCθ与共刺激受体CD28的结合。这些DMF敏感的半胱氨酸突变也削弱了PKCθ-CD28的相互作用和T细胞的活化，表明PKCθ的C2结构域是对T细胞生物学重要的关键功能电亲感模块。         

研究流程：    

1、确定DMF活性和作用方式：

研究发现，DMF浓度依赖性地抑制了抗-CD3/CD28激活的人类初级T细胞中的IL-2分泌和早期激活标志物的表达，其作用与Nrf2激活或谷胱甘肽（GSH）耗竭无关，而单甲基富马酸酯（MMF）和二甲基琥珀酸酯（DMS）则无此效应。

2、isoTOP-ABPP鉴定作用靶点：

使用亲电探针IA-alkyne反向读取了DMF对蛋白质半胱氨酸残基的结合能力，结果显示在人T细胞中，超过2400个半胱氨酸中约40个在DMF处理下显著减少标记（>4倍），而MMF或BSO处理下未见变化，表明DMF特异性影响这些残基的反应性。DMF的作用具有浓度和时间依赖性，且其对半胱氨酸残基的影响在小鼠和人类中具有保守性，在人类T细胞中发现的DMF敏感半胱氨酸残基中约有三分之二在小鼠中也存在，并显示出相似的敏感性。    

3、功能验证：

通过突变实验验证DMF敏感的半胱氨酸在T细胞中的功能，发现DMF特异性地抑制了PKCθ的C2结构域中半胱氨酸残基Cys14和Cys17的反应性，这种抑制具有浓度和时间依赖性，并阻止了PKCθ与CD28的相互作用，从而影响T细胞激活。Cys14和Cys17在调控免疫细胞中激酶信号复合体形成中起重要作用，这些残基位于PKCθ的C2结构域，而其它PKC亚型中没有对应的CXXC序列，表明DMF的作用可能特异于PKCθ。

结论与意义：

这一发现不仅填补了DMF作用机制研究的空白，更为我们理解T细胞如何被调控打开了全新的窗口。未来，随着对DMF及其他免疫调节药物作用机理的深入探索，我们有望开发出更加精准有效的治疗策略，为患者带来福音。