微生物电发酵能够通过电极提供电子促进还原力再生，从而还原廉价底物转化为高能化学品，同时能够将还原力供给从中心代谢途径解耦，使得底物全部用于碳骨架合成，从而提高碳原子经济性，最终实现绿色循环可持续发展。微生物电发酵过程中，电子传递速率慢、还原力转化效率低、还原力能量定向分配特异性差仍是限制其规模化应用的主要瓶颈，先前的研究通过合成生物学策略和电极材料改造提高直接、间接以及界面电子传递速率，从而提高电合成效率。然而，细胞内还原当量及时、有效的供应和定向分布的研究却鲜有报告，还原力供给效率低和分配特异性差，大大降低了底物到产物的转化效率。

细胞内还原当量是细胞资源的重要组成部分。及时和适当地供应还原当量对于还原性生产是必要的。另一方面，还原当量和代谢通量的定向和具体分配对目标产品的净产量也至关重要。然而，盲目提高细胞内 NADH 浓度可能会扰乱辅因子平衡并导致生长缺陷，从而不能提高化合物最终产量。此外，天然途径经常与目标途径竞争前体和还原当量，从而限制了所需化学品的总产率。因此，开发自主和动态控制调控网络，实现还原当量的高效和定向分配至关重要。之前的研究开发了基于氧化还原转录因子（如 SoxR、OxyR、ArcA）和氧化还原分子（如绿脓菌素、过氧化氢、铁氰化钾、甲基萘醌等）的电遗传调控系统，并结合 CRISPR 技术调控细胞行为和代谢网路，然而，直接响应胞内还原力分子的电遗传调控系统尚未开发。

2024 年 10 月 29 日，天津大学化工学院李锋/宋浩教授团队于 Cell 子刊Joule杂志发表题为“Electro-controlled distribution of reducing equivalents to boost isobutanol biosynthesis in microbial electro-fermentation of S. oneidensis”的论文，报道了一种能够直接响应胞内 NADH/NAD+ 比例的智能电控系统，通过电位调控异丁醇电发酵代谢通路，实现胞内还原力的高效定向分配。天津大学化工学院 2019 级蔚欢博士为论文第一作者，李锋副教授和宋浩教授为论文共同通讯作者。

在本研究中，作者首先构建了一株含有异丁醇电合成途径的希瓦氏工程菌，发酵产量达 122 mg/L。随后通过外加 -0.6 V 电位进行电合成，产量达 256 mg/L。然而，由于过量供给还原力导致胞内氧化还原失衡，极大降低细胞存活率。因此，为了缓解氧化还原不平衡导致的细胞活力受阻，开发了一个双阶段电合成技术，即先 +0.5 V 两天通过电极呼吸进行细胞生长和生物膜形成，再 -0.6 V 十天进行电合成，将电发酵分为“细胞生长”和“产物合成”两个阶段，显著提高发酵过程中菌体量和存活率，并将产量提高至 400 mg/L。

图 1 | 异丁醇合成途径的构建以及双阶段电发酵工艺的开发

随后，为了解除 +0.5V 下异丁醇途径的过早表达带来的生长代谢负荷，作者进一步开发了一个响应 NADH/NAD+ 比例的生物传感器，即基于转录因子 Rex 的生物传感器，其对 NAD+ 和 NADH 具有不同的结合活性，与 NAD+ 结合时发挥转录抑制作用，与 NADH 结合时解除抑制，从而实现响应不同电位和 NADH/NAD+ 比例时基因的表达开关转换。基于此，我们构建了电控基因表达系统，实现了异丁醇合成途径正电位开和负电位关。此电控系统进一步提高了电合成过程中细胞的存活率和电极生物量，促进了正电位生物膜形成和负电位的电子吸收速率，实现了负电位下还原力的精准供给，彻底解耦细胞生长和产物合成过程，将异丁醇产量提高至 773mg/L，产率达到 0.239g/g 乳酸，是理论最高产率的 58.1%。

图 2 | NADH/NAD+ 生物传感器动态调控异丁醇合成实现还原力高效供给

最后，为了实现还原力和碳源靶向异丁醇途径的定向分配，作者开发了一个电控 CRISPR 抑制系统（eCRISPRi），利用 NADH 传感器智能调控 dCas9 蛋白的表达，通过响应不同电位下 NADH/NAD+ 比例，实现在负电位下动态启动对还原力和前体竞争途径的抑制；并筛选了五个靶向基因，发现抑制丙酮酸裂解途径不仅能够减少副产物甲酸乙酸合成，还能降低 NADH 的消耗，最终将异丁醇的产率提高至 1321mg/L，是出发菌株的 10.8 倍，同时产率达到 0.394g/g 乳酸，是出发菌株的 10.4 倍，并达到了理论最高产率的 94.9%。

图 3 | 电控 CRISPRi 转录抑制系统实现还原力靶向目标途径的定向分配

本研究通过三种策略协同互补：策略一（双阶段电发酵工艺），策略二（引入 NADH/NAD+ 生物传感器）和策略三（电控 CRISPR 转录抑制技术）在希瓦氏菌中构建了一套智能电控系统，实现了异丁醇产量和产率的大幅提高，为微生物电发酵过程中还原力的高效定向供给提供了新策略。

图 4 | 概念图和策略总结

在本系统中，电极不仅可以作为电子源促进还原力再生，还能作为基因调控开关，实现还原力靶向目标途径的高效智能分配，为电调控和电遗传系统的进一步开发奠定了基础。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、天津市科技计划项目等基金的支持。

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